Оценка факторов врожденного иммунитета слизистой цервикального канала в прогнозировании преждевременных родов 14. 00. 01. Акушерство и гинекология 14. 00. 36. Аллергология и иммунология

доктор медицинских наук, профессор Макаров Олег Васильевич

доктор медицинских наук, профессор Ганковская Людмила Викторовна
Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кузьмин Владимир Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Стенина Марина Александровна
Ведущая организация:

ГУ Московский областной НИИ акушерства и гинекологии Министерства здравоохранения Московской области (МОНИИАГ).

Автореферат разослан «17» октября 2009 года.

доктор медицинских наук, профессор Хашукоева Асият Зульчифовна

Среди основных проблем практического акушерства преждевременные роды занимают одно из первых мест, так как именно они определяют перинатальную заболеваемость и смертность. На долю недоношенных детей приходится 60 — 70% ранней неонатальной смертности (Кулаков В.И. и соавт., 2002; Макаров О.В. и соавт., 2007; Сидельникова В.М., 2001). Многие ученые всего мира работают над проблемами патогенеза, прогнозирования и терапии преждевременных родов (Сидельникова В.М. и соавт., 2006; Goldenberg R.L. et al, 2003, Iams J.D., 2003).

Поиск дополнительных сведений о механизмах развития преждевременных родов позволит разработать препараты патогенетического действия, что должно помочь врачам всего мира справиться с проблемой снижения частоты недонашивания беременности.

По современным представлениям более трети преждевременных родов происходят вследствие инфицирования плодных оболочек (Shim S.S. et al, 2004).

Проникновение инфекционных агентов в матку приводит к разрушению плодных оболочек, активизации цитокинового каскада, который инициирует сокращения миометрия, приводит к инфицированию плода. Однако, восходящее продвижение микроорганизмов невозможно при нормальной локальной защите, при адекватно функционирующей местной иммунной системе. Обнаружение сбоев на этом уровне и своевременная коррекция нарушений позволит предотвратить одну из основных причин наступления преждевременных родов.

Оценить вероятность наступления преждевременных родов очень сложно. Жалоб на тянущие боли в нижних отделах живота недостаточно для выставления диагноза: «угроза преждевременных родов». Выделено множество социальных, демографических и медицинских факторов риска преждевременных родов, но если даже опираться на них, группа высокого риска будет слишком велика, чтобы использовать ее для проведения профилактического лечения (McPheeters M.L., 2005). Традиционно в качестве маркеров предстоящих преждевременных родов рассматривают укорочение шейки матки и появление в цервикальной слизи фетального фибронектина. Однако, специфичность этих методов недостаточно высока (Leitich H. et al, 2003; Iams J.D., 2001).

В последние годы активно изучается роль факторов врожденного иммунитета в развитии преждевременных родов. Доказано, что началу родовой деятельности предшествует запуск цитокинового каскада, результатом которого является продукция простагландинов и ферментов, способствующих сокращениям матки и раскрытию шейки матки (Goldenberg R.L., 2003; Макаров О.В. и соавт., 2007).

Решение проблемы прогнозирования преждевременных родов позволит осуществлять отбор пациенток для целенаправленного лечения. Раскрытие секретов патогенеза даст возможность разрабатывать новые препараты для лечения и предупреждения преждевременных родов.

1. 
   Провести комплексное клинико-лабораторное обследование пациенток с угрозой прерывания беременности во II и III триместрах с учетом известных факторов риска развития преждевременных родов.
   
2. 
   Сравнить показатели компонентов локального врожденного иммунитета слизистой цервикального канала (TLR2, HBD1) у здоровых небеременных женщин и пациенток с воспалительными заболеваниями органов малого таза.
   
3. 
   Сопоставить уровни экспрессии генов TLR2 и HBD1 клетками слизистой цервикального канала у здоровых небеременных и женщин с физиологически протекающей беременностью в конце II, начале III триместра беременности.
   
4. 
   Оценить изменения компонентов врожденного иммунитета у беременных на фоне урогенитальных инфекций.
   
5. 
   Сопоставить уровни экспрессии генов TLR2 и HBD1 слизистой цервикального канала у беременных с УГИ, родивших преждевременно и в срок.
   
6. 
   Исследовать компоненты врожденного иммунитета слизистой цервикального канала (TLR2, HBD1) при бактериальном вагинозе.
   
7. 
   Определить роль параметров врождённого иммунитета как возможных маркёров недонашивания беременности.
   

Впервые в России проведена оценка экспрессии генов TLR2 и HBD1 слизистой цервикального канала у здоровых беременных в сравнении с небеременными.

Определены критерии, позволяющие с высокой точностью прогнозировать преждевременные роды. По поводу использования экспрессии гена HBD1 в качестве маркера предстоящих преждевременных родов подана заявка на изобретение в федеральную службу по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам под номером 2009108294 от 10.03.2009.

Подтверждена активация системы врожденного иммунитета у здоровых беременных. Проведён анализ исходов беременности у пациенток с угрозой прерывания во II-III триместрах и показателей корреляции между повышением экспрессии гена TLR2 и снижением экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 эпителиальными клетками цервикального канала при преждевременных родах, что свидетельствует о дисбалансе системы врождённого иммунитета. Полученные данные об изменении экспрессии генов TLR2 и HBD1 у беременных высокого инфекционного риска помогли расширить представление о роли механизмов врождённого иммунитета в патогенезе невынашивания беременности.

Определены изменения врожденного иммунитета при бактериальном вагинозе и сформулирована гипотеза о причинах корреляции между наличием данной патологии и частотой преждевременных родов.
Положения, выносимые на защиту

1. 
   По сравнению со здоровыми небеременными у женщин с воспалительными заболеваниями органов малого таза возрастает уровень экспрессии гена TLR2 клетками слизистой цервикального канала, а экспрессия гена HBD1 снижается.
   
2. 
   Физиологическое течение беременности сопровождается повышением активности врождённого иммунитета на локальном уровне, что определяет защиту от восходящего инфицирования.
   
3. 
   Исследование компонентов врождённого иммунитета (TLR2, HBD1) на локальном уровне (эпителиальные клетки цервикального канала) имеет большое значение в прогнозировании восходящего инфицирования у небеременных и во время беременности.
   
4. 
   В патогенезе бактериального вагиноза важную роль играет дисбаланс показателей врожденного иммунитета.
   
5. 
   Снижение уровня экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 как прогностический фактор для преждевременных родов обладает высокой чувствительностью.
   

Определение факторов риска преждевременных родов позволяет выделить когорту беременных для проведения динамического клинико-лабораторного контроля состояния будущей матери с применением современных технологий. Диагностика нарушений врождённого иммунитета даёт возможность своевременно прогнозировать развитие осложнений беременности и определить показания к назначению терапии, направленной на пролонгирование беременности, антибактериальной и иммунокорригирующей терапии у беременных.

Определены диагностические критерии с учётом механизмов врождённого иммунитета, позволяющие с высокой точностью прогнозировать преждевременные роды. Снижение экспрессии гена HBD1 эпителиальными клетками цервикального канала рекомендуется в качестве маркёра предстоящих преждевременных родов.

Определены механизмы реализации восходящего инфицирования у пациенток ВЗОМТ, беременных с бактериальным вагинозом, невынашиванием беременности, что требует проведения соответствующей терапии.

Материалы диссертационного исследования используются в практике учебно-педагогического процесса на кафедре акушерства и гинекологии лечебного факультета РГМУ, кафедре иммунологии РГМУ и в практической работе родильного отделения городской больницы №8 г. Москвы.

По поводу использования экспрессии гена HBD1 в качестве маркера предстоящих преждевременных родов подана заявка на изобретение в федеральную службу по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам под номером 2009108294 от 10.03.2009.
Апробация

Апробация диссертации состоялась на объединенной научно-практической конференции сотрудников кафедр акушерства и гинекологии и иммунологии Российского государственного медицинского университета, сотрудников городской клинической больницы №55, городской больницы №8, родильного дома №10 08 сентября 2009 года.

Материалы диссертации представлены на III Международном конгрессе по репродуктивной медицине, Конференции молодых ученых по молекулярной биологии и генетике, посвященной 120-летию М.И. Вавилова, Киев, Украина, 20—22 сентября, 2007; II Международной (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, 2009г.; IV Ежегодном конгрессе специалистов перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технологии и качество», 2009 г.,, III Международном конгрессе по репродуктивной медицине, 2009; XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 6-10 апреля 2009г
Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 статей в центральной печати.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, содержащего 92 отечественных и 139 зарубежных источников. Работа выполнена на 139 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 таблицами и 29 рисунками.

Исследование проводили в 2006-2009 гг. на клинических базах кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета РГМУ (заведующий кафедрой д.м.н., профессор, заслуженный врач РФ О.В. Макаров): в родильном отделении городской больницы №8 ДЗ г.Москвы (главный врач А.Б. Дуленков), женской консультации при родильном доме №10 УЗ ЮЗАО г. Москвы (главный врач Е.П. Озимковская) и городской клинической больнице №55 ДЗ г. Москвы (главный врач д.м.н., проф. О.Н. Румянцев) совместно с кафедрой иммунологии медико-биологического факультета РГМУ (заведующий кафедрой, д.м.н., профессор Л.В. Ковальчук).

Проведено клиническое и лабораторное обследование 120 женщин. Из них 60 составили основную группу, в которую вошли беременные в сроках 26-32 недели, поступившие в родильный дом при городской больнице №8 с диагнозом угроза преждевременных родов, у которых ранее было выявлено носительство урогенитальных инфекций.

Все пациентки основной группы получали стандартное комплексное лечение, направленное на пролонгирование беременности, несмотря на это, у 20 женщин из 60 беременность закончилась преждевременными родами в сроках 29—37 недель, остальные 40 родили в срок. Группа пациенток с преждевременными родами была выделена как группа Iа. Кроме того, при первичном анализе показателей врожденного иммунитета слизистой цервикального канала были выявлены запредельно высокие показатели экспрессии генов TLR у женщин с бактериальным вагинозом. Высокие значения искажали общую картину, что потребовало выделения этих беременных в отдельную группу (Iв). Таким образом, в группу Iб были отнесены пациентки, носители урогенитальных инфекций без признаков бактериального вагиноза, родившие в срок. В три группы контроля вошло по 20 человек.

Первая контрольная группа была составлена из 20 женщин с физиологически протекающей одноплодной беременностью в сроке 26—32 недели. Во вторую контрольную группу были включены 20 здоровых небеременных женщин. Третья контрольная группа состояла из 20 женщин с воспалительными заболеваниями органами малого таза (ВЗОМТ).

Методы клинического обследования: В исследуемых группах изучали: данные анамнеза, течение настоящей беременности, особенности родового акта, оценивали состояние новорожденных. Всем пациенткам проводили комплексное клинико–лабораторное обследование (клинический анализ крови и мочи, определение группы крови и резус-фактора, биохимический анализ крови, гемостазиограмму, анализ микрофлоры влагалища и цервикального канала бактериологическим методом и методом ПЦР). Ультразвуковой скрининг проводили у всех беременных на аппарате «Aloka 4000» (Япония) с использованием трансабдоминальных и эндовагинальных датчиков. Для наблюдения за состоянием плода с 30 недель беременности использовали антенатальную кардиотокографию при помощи мониторов фирмы «Hewlett Packard» (США).

Морфологическое исследование последов осуществляли в патологоанатомических лабораториях ДГКБ №1 (главный врач В.Л.Фомина).

Полученные цифровые результаты исследования обрабатывали методами вариационной статистики. Среднюю статистическую величину М, среднеквадратичное отклонение σ, ошибку средней m и коэффициенты корреляции r вычисляли на компьютере с использованием пакета прикладных программ для статистической обработки «Statistika» версия 7.0 и программы «Биостат» издательства «Практика». Для определения достоверности различий между выборками, учитывая различную дисперсию и ненормальное распределение значений, применяли непараметрические статистические методы (критерий Манна-Уитни).

Различия между сравниваемыми величинами признавали статистически достоверными при уровне значимости р < 0,05. Оценку корреляционной зависимости для непараметрических, ранговых величин проводили по методу Спирмена.

Возраст беременных в исследуемых группах достоверно не отличался и находился в пределах от 18 до 38 лет. Для большинства женщин с угрозой преждевременных родов в отличие от беременных с физиологически протекающей беременностью данная беременность была первой.

В группе здоровых беременных количество самопроизвольных выкидышей в анамнезе было достоверно меньшим, чем у женщин с угрозой преждевременных родов.

Несмотря на то, что преждевременные роды в анамнезе, по данным литературы, являются независимым фактором риска преждевременных родов, в нашем анализе преждевременные роды в анамнезе были лишь в группах срочных родов (Iб) и здоровых беременных (II), у 2 (8,3%) и 3 (15%) женщин соответственно.

Частым спутником угрозы прерывания беременности является соматическая патология. В группе женщин с бактериальным вагинозом выявлена высокая встречаемость хронического пиелонефрита У женщин с угрозой прерывания чаще встречались ожирение и хроническая артериальная гипертензия.

До наступления настоящей беременности многие женщины страдали гинекологическими заболеваниями. В основной группе несколько чаще встречались миома матки, бесплодие и хронический сальпингоофорит.

При статистической обработке данных выявлены различия в частоте встречаемости осложнений настоящей беременности. У 3 пациенток основной группы во время беременности обострялась герпетическая инфекция, в контрольной группе таких женщин не было. Женщины, родившие преждевременно чаще переносили ОРВИ с повышением температуры более 37,5⁰С в I триместре беременности 40%, по сравнению с 16,67% в группе УГИ, родивших в срок и 25% в контрольной группе.

Урогенитальные инфекции, критерий отнесения пациенток к I группе, распределились в подгруппах a и б следующим образом: в группе женщин, родивших преждевременно, отмечалось преобладание бактериальной инфекции. Видовой состав бактериальных агентов в группах не различался: преобладали Ureaplasma parvum, реже встречались Mycoplasma hominis. Из вирусных инфекций примерно с одинаковой частотой выявляли вирус простого герпеса и цитомегаловирус.

Мы проанализировали изменения уровней экспрессии генов TLR2, TLR6 и HBD1 в слизистой цервикального канала у беременных с физиологически протекающей беременностью по сравнению с небеременными.

По данным литературы, доказанным считается активация у беременных системы врожденного иммунитета на фоне подавления адаптивного (Кокряков В.Н., 2006; Макаров О.В. и соавт., 2007; Keelan J.A. et al, 2003).

Активация системы естественного иммунитета во время беременности обеспечивает эффективную защиту организма от большинства бактериальных инфекций. Однако этого часто бывает недостаточно для элиминации внутриклеточных возбудителей, таких как листерии или вирусы. Поэтому вирусные инфекции во время беременности могут протекать тяжелее, чем вне беременности. В тоже время, гиперактивация системы естественного иммунитета во время беременности может служить одним из факторов развития таких нарушений, как невынашивание беременности и гестоз. Аналогично системным изменениям смещается иммунное равновесие и на местном уровне (Макаров О.В. и соавт., 2007).

езультаты нашего исследования полностью подтверждают эти данные и в значительной мере дополняют. Краеугольным камнем системы врожденного иммунитета, обеспечивающим его связь с адаптивным иммунитетом и самостоятельно запускающим цитокиновый каскад, являются Toll-подобные рецепторы. Мы показали, что экспрессия гена TLR2 значительно возрастает в слизистой цервикального канала при беременности (0,8 ± 0,01 х 10⁶ копий кДНК по сравнению с 0,05 ± 0,012 х 10⁶ у здоровых небеременных пациенток). А ведь именно TLR2 связывает максимальное количество лигандов, обеспечивая защиту от большинства бактериальных патогенов.

П

*

* р<0,05 по сравнению со здоровыми небеременными

араллельно с экспрессией TLR2 возрастала и экспрессия гена противомикробного пептида β-дефензина 1. Данный белок обеспечивает защиту от патогенов, обладая непосредственным цитотоксическим действием, а также иммуномодулирующей активностью.

Таким образом, на основании полученных данных мы можем сделать вывод, что на локальном уровне в шейке матки, как и на системном, при беременности снижение активности адаптивного иммунитета компенсируется значительной активацией системы врожденного иммунитета. Эти изменения позволяют обеспечить иммунную привилегию плода при сохранении достаточной защиты от инфекции.

В последнее время уделяется большое внимание иммунологическим аспектам развития преждевременных родов. Несмотря на обширные исследования в области репродуктивной иммунологии, следует отметить, что большинство из них освещает данную проблему с позиций системных иммунных реакций. В то же время, мы считаем перспективным изучение местного иммунитета на уровне гистологических барьеров (в частности слизистой цервикального канала) при физиологически протекающей беременности и при патологии гестационного процесса. Именно эти изменения, по-видимому, являются звеном патогенеза осложнений беременности и их вероятным предиктором (Challis J.R., 2001; Grimes D.A, 2006).

По современным представлениям более трети преждевременных родов происходят вследствие инфицирования плодных оболочек (Shim S.S. et al, 2004)

Однако, развитие преждевременных родов инфекционного генеза возможно лишь при фоновых изменениях иммунной системы. В норме локальные защитные механизмы не позволяют микроорганизмам проникать в матку, причем основная роль в этой защите отводится врожденному иммунитету. Возможность восходящего инфицирования в большей мере зависит от состояния локального иммунитета в пограничной зоне между влагалищем и маткой — шейке матки, чем от системных иммунных реакций (Xu J. et al, 2008).

Цервикальный канал выстлан цилиндрическим эпителием. Микроорганизмы, поражающие эпителий, и их продукты встречаются с факторами защиты, которые служат барьером на пути их проникновения в ткани. Факторы врожденного иммунитета существуют в организме до начала воздействия инфекционного агента, кроме того, при воздействии патогенных факторов быстро (в течение минут, часов) индуцируется их дополнительный синтез.

Распознающими рецепторами врожденной иммунной системы являются Toll подобные рецепторы, которые экспрессируются клетками эпителия, макрофагами, дендритными клетками, и др.

Воздействие микроорганизмов через активацию специфических рецепторов TLR приводит к продукции цитокинов. Увеличение синтеза цитокинов в шейке матки является причиной ее открытия. Открытию шейки матки также способствует активация протеаз. Повышение активности протеаз может привести к изменению структуры плодных оболочек и их преждевременному разрыву (Byrne B., et al, 2003). Продукция провоспалительных цитокинов способствует увеличению синтеза простагландинов в децидуальной ткани и миометрии и преждевременному началу родовой деятельности (Challis J.R.G., 2000).

HBD1 является универсальным биологически активным веществом с бактерицидным действием. Экспрессия генов дефензинов эпителиальными клетками слизистой объясняется необходимостью ее защиты от постоянного действия условно патогенных и патогенных микроорганизмов. Дефензины способны модулировать продукцию цитокинов, и обладают прямым цитотоксическим действием.

Н

ами проведены исследования по изучению экспрессии генов TLR2 и HBD1 клетками слизистой цервикального канала у здоровых беременных (группа II), беременных с урогенитальными инфекциями, родившие в срок (группа Iб) и родившие преждевременно (группа Ia).

По сравнению со здоровыми беременными в группе беременных с УГИ, родивших преждевременно, экспрессия гена TLR2 слизистой цервикального канала была значительно повышена (рисунок 4). При этом в группе Iб (носители УГИ срочные роды) экспрессия гена TLR2 практически не отличалась от таковой у здоровых беременных.

Результаты нашего исследования указывают на предшествующую преждевременным родам гиперэкспрессию TLR2 слизистой цервикального канала, которая в свою очередь приводит к запуску цитокинового каскада и разворачиванию родовой деятельности (ранее в литературе показано, что перед прерыванием беременности в цервикальном канале возрастает концентрация ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-γ и других противовоспалительных цитокинов (Макаров О.В. и соавт, 2007).

С

*

* р<0,05 по сравнению с родившими в срок носителями УГИ

ниженная экспрессия гена противомикробного пептида HBD1 клетками слизистой цервикального канала отмечалась в основной группе с невынашиванием беременности. Возможно, это приводило к нарушению противомикробной защиты на уровне слизистой цервикального канала.

В группе женщин с урогенитальными инфекциями и благоприятным исходом беременности уровень экспрессии гена HBD1 был значительно выше и не отличался от показателя здоровых беременных женщин (рисунок 5).

Как видно из сравнения показателей экспрессии генов TLR2 и HBD1 у небеременных женщин и беременных с угрозой преждевременных родов изменения, происходящие в локальной иммунной системе перед преждевременными родами, аналогичны сдвигам, происходящим во время воспалительных заболеваний органов малого таза. То есть, восходящее инфицирование придатков матки вне беременности и проникновение инфекционного агента в матку при беременности, по всей видимости, имеют схожий патогенез. Для того чтобы эти процессы были возможны, необходимо снижение местной защиты в виде уменьшения экспрессии гена HBD1. При этом, усиление экспрессии гена TLR2, может быть, реакцией на проникновение микроорганизма.
Рисунок 6. Изменения экспрессии генов TLR2 (10⁵ копий) и HBD1 (10³ копий) слизистой цервикального канала при воспалительных процессах органов малого таза и преждевременных родах

по оси ординат — количество копий кДНК х 10⁶ по отношению к 10⁶ копий β-актина

Ia беременные с УГИ, преждевременные роды

II здоровые беременные

III здоровые небеременные

IV небеременные с ВЗОМТ

* р<0,05 по сравнению со здоровыми небеременными

** р<0,05 по сравнению со здоровыми беременными

Учитывая максимальные изменения в локальном иммунитете, cпорным является системная терапия препаратами иммуноглобулина, особенно назначаемая в «профилактических» целях. Вероятно, перспективным направлением профилактической иммунокоррекции могут явиться местные иммунокорригирующие препараты, однако, и их назначение требует соответствующего предварительного обследования.

Многие ученые во всем мире работают над проблемой прогнозирования преждевременных родов, но полученные к настоящему моменту данные по-прежнему не позволяют четко выделить пациенток высокого риска по развитию этой патологии. Одним из наиболее исследованных факторов является длина шейки матки по данным УЗИ. Мы в своих расчетах опирались на предлагаемую большинством авторов границу нормы в 25 мм. Полученные нами результаты в целом согласуются с данными литературы, в том, что этот метод при относительно высокой специфичности характеризуется низкой чувствительностью. В нашем исследовании чувствительность равнялась 55%. В работах других авторов данный показатель был и того ниже, не превышая 50% Iams J.D. et al, 2003, Goldenberg R.L. et al, 2003).

С целью улучшения прогнозирования преждевременных родов мы проанализировали экспрессию HBD1 слизистой цервикального канала у беременных с УГИ и сравнили показатели женщин, родивших преждевременно и женщин, родивших в срок.

В случае если уровень экспрессии гена HBD1 был ниже 25 х 10³ копий кДНК, вероятность наступления преждевременных родов составила 64,28%, а если выше 25 х 10³ кДНК — 8,2%. Из всех женщин, родивших преждевременно, у 91,7% уровень экспрессии гена HBD1 был ниже 25 х 10³ кДНК. По всем 4 значениям ценности прогностического фактора для уровня экспрессии гена HBD1 нами были получены очень хорошие результаты. Чувствительность, специфичность, положительное и отрицательное прогностическое значение теста были оценены нами как 86,7%; 66,7%; 72,2% и 85,7% соответственно.

Оценка экспрессии HBD1 в прогнозировании преждевременных родов позволило добиться хороших показателей (чувствительность 86,7%). Для сравнения тест на содержание эстриола в слюне был официально утвержден в качестве маркера для определения преждевременных родов в США при чувствительности 71%.

Полученные нами результаты в прогнозировании преждевременных родов на основании уровня экспрессии гена HBD1, особенно в комплексе с длиной шейки матки по данным УЗИ, позволят улучшить отбор женщин для проведения специфической терапии. Более тщательный выбор пациенток группы высокого риска по развитию преждевременных родов позволит значительно снизить затраты на лечение «угрозы преждевременных родов», которое на данный момент в популяции ожидаемых результатов не дает. Эффективность лечения при правильном подборе целевой популяции также должна возрасти.

Несмотря на разработку новых препаратов для лечения и предупреждения преждевременных родов частоту их снизить не удается.

Используемые в настоящее время препараты для предупреждения и лечения преждевременных родов, такие как: β-адреномиметики, антагонисты окситоцина, ингибиторы циклооксигеназы и сульфат магния - блокируют сокращения миометрия. Несмотря на достаточно большой опыт применения этих препаратов и большое количество клинических исследований, не получено достоверных данных о значительном пролонгировании беременности с помощью одного из них. При этом, их применение может быть связано с серьезными побочными эффектами (со стороны сердечно-сосудистой системы, преждевременное закрытие артериального протока и т.д.).

Эффективность токолитиков ограничивается несколькими сутками, что позволяет лишь провести профилактический курс кортикостероидов, снижая риск респираторного дистресс-синдрома, внутрижелудочковых кровоизлияний, некротического энтероколита и гибели ребенка. Кроме того, острый токолиз может позволить осуществить транспортировку матери в центр, оснащенный детской реанимацией (Denney J.M., 2008).

Возможно, такие результаты применения современных токолитических препаратов связано с тем, что они действуют на конечный этап патогенеза преждевременных родов – маточные сокращения.

Вполне вероятно выработанные нами критерии позволят точнее отбирать беременных группы высокого риска для профилактической терапии антибактериальными препаратами.

Учитывая полученные нами результаты, указывающие на первичность иммунных сдвигов в патогенезе преждевременных родов, сочетанная терапия антибиотиками и иммуномодуляторами у пациенток, отобранных по предлагаемым нами критериям, может дать положительные результаты.

Описано исследование применения антагониста TLR-4 в предотвращении преждевременных родов, проведенного на макаках резус (Adams Waldorf K.M., 2008). В нашей работе мы подтвердили, что развитию преждевременных родов предшествует гиперэкспрессия гена TLR. Разработка антагонистов других TLR и их применение у пациенток группы высокого риска (при повышенной экспрессии генов TLR) может предотвратить разворачивание цитокинового каскада и запуск родовой деятельности. Также эффективным может оказаться их сочетанное применение с антибактериальными препаратами.

При исследовании показателей врожденного иммунитета слизистой цервикального канала при бактериальном вагинозе, мы получили следующие результаты: Значительное увеличение экспрессии гена TLR2 (78,2 ± 16,2 x 10⁶ копий кДНК по сравнению с 0,8 ± 0,01 x 10⁶ у здоровых беременных) и снижение экспрессии гена HBD1 (38.6 ± 4.1 х 10³ копий кДНК по сравнению с 87,8 ± 8,8 х 10³ у здоровых беременных).

Основываясь на полученных нами и другими исследователями данных (Кира Е.Ф., 2001, Brocklehurst P. et al, 2000, Hillier S. et al, 2001), можно предположить, что причиной развития осложнений, связанных с бактериальным вагинозом, являются иммунные сдвиги, сопровождающие данную патологию.

Изменения локальной иммунной системы при БВ, выявленные в ходе нашей работы (увеличение экспрессии гена TLR2 и снижение экспрессии гена HBD1) аналогичны тем, которые по нашим данным предшествуют развитию преждевременных родов. Вполне возможно, эти изменения являются не следствием БВ, а одним из звеньев его патогенеза (Xu J. et al, 2008).

Снижение местной защиты при низком уровне экспрессии гена HBD1 создает условия для размножения условно-патогенных микроорганизмов. Эти выводы можно подтвердить исследованием экспрессии генов TLR и HBD в слизистой влагалища. В ранних исследованиях было показано, что при бактериальном вагинозе возрастает экспрессия генов TLR2 и TLR-4 в слизистой влагалища (Grenache D.G. et al., 2004).

Таким образом, иммунные изменения в слизистой цервикального канала при БВ могут быть не результатом, а фоном для его развития, как и для развития преждевременных родов. То есть бактериальный вагиноз, наличие которого, по данным литературы увеличивает вероятность преждевременных родов более чем в 2 раза, является своеобразным маркером локальных иммунных изменений, которые в свою очередь приводят к недонашиванию беременности.

Для определения возможности применения показателей врожденного иммунитета слизистой цервикального канала в качестве независимых маркеров локальный иммунных изменений, мы провели корреляционный анализ этих показателей с уровнем лейкоцитов крови, с количеством палочкоядерных лейкоцитов в лейкоцитарной формуле и количеством лейкоцитов в общем анализе мочи. Для всех 3 перечисленных показателей коэффициент корреляции находился в пределах от -0,3 до +0,3, что не является достаточным для установления наличия связи между исследуемыми показателями.

Учитывая результаты корреляционного анализа, мы можем с уверенностью говорить, что изменения локальной системы врожденного иммунитета шейки матки не зависят от системных воспалительных реакций (уровень лейкоцитов крови, количество палочкоядерных лейкоцитов) и воспалительных изменений в органах, располагающихся в непосредственной близости от шейки матки (количество лейкоцитов в моче). Такие результаты говорят о высокой специфичности данного метода в определении локальной способности организма препятствовать проникновению инфекции.

Таким образом, наши результаты подтверждают мнение о компенсаторной активации системы врожденного иммунитета во время беременности. Показано, что Toll подобные рецепторы, как основные рецепторы врожденного иммунитета, могут служить маркерами осложнений беременности, а также потенциальной мишенью новых терапевтических вмешательств.

Сочетание повышенной экспрессии гена TLR2 и недостаточной экспрессии гена HBD1 является характерным состоянием, для различных патологических состояний – воспалительных заболеваний органов малого таза, бактериального вагиноза и преждевременных родов.

С высокой точностью прогнозировать преждевременные роды позволит сочетанная оценка экспрессии гена HBD1 слизистой цервикального канала и длины шейки матки про помощи УЗИ.

1. 
   К факторам риска преждевременных родов относятся: наличие в анамнезе самопроизвольных прерываний беременности в первом триместре; работа, связанная со стрессом; ожирение; хроническая артериальная гипертензия; перенесенная в I триместре ОРВИ.
   
2. 
   В клетках слизистой цервикального канала здоровых небеременных женщин экспрессируются гены TLR2 и HBD1, причем на фоне воспалительных заболеваний органов малого таза экспрессия гена TLR2 возрастает, а экспрессия противомикробного пептида HBD1 снижается
   
3. 
   Физиологическое течение беременности сопровождается повышением активности компонентов врожденного иммунитета, что на локальном уровне проявляется повышением экспрессии TLR2 и противомикробного пептида HBD1 слизистой цервикального канала.
   
4. 
   При преждевременных родах экспрессия гена TLR2 клетками слизистой цервикального канала значительно возрастает, экспрессия гена прготивомикробного пептида β-дефензина 1 напротив снижается.
   
5. 
   С высокой чувствительностью прогнозировать преждевременные роды позволяет оценка экспрессии HBD1. Определение уровня экспрессии HBD1 слизистой цервикального канала ниже 25 х 10³ копий кДНК прогнозирует преждевременные роды с отрицательной прогностической ценностью 85,7% и чувствительностью 86,7%.
   
6. 
   Изменения экспрессии компонентов врожденного иммунитета слизистой цервикального канала при бактериальном вагинозе аналогичны предшествующим преждевременным родам.
   

1. 
   Наличие у беременной в анамнезе самопроизвольных прерываний беременности в первом триместре; работы, связанной со стрессом; ожирения; хронической артериальной гипертензии; перенесенной в I триместре ОРВИ дают основание относить данный контингент к группе риска по недонашиванию беременности и соответственно проводить целенаправленное обследование и соответствующее лечение.
   
2. 
   Для своевременного прогнозирования преждевременных родов в комплексе обследования беременных высокого инфекционного риска целесообразно включать оценку показателей врожденного иммунитета с обязательным определением уровня экспрессии противомикробного пептида HBD1.
   
3. 
   Снижение экспрессии противомикробного пептида HBD1 слизистой цервикального канала ниже 25 х 10³ копий кДНК относительно 10⁶ копий β-актина в сочетании с укорочением шейки матки по данным УЗИ менее 25 мм позволяет с высокой точностью отнести данных пациенток к группе высокого риска по развитию преждевременных родов.
   

Список условных обозначений

БВ — бактериальный вагиноз

ВЗОМТ — воспалительные заболевания органов малого таза

ВПГ — вирус простого герпеса

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ИЛ — интерлейкин

ИФ — интерферон

ИФА — иммуноферментный анализ

кДНК — комплементарная ДНК — это ДНК, синтезированная из зрелой мРНК в ходе реакции обратной транскрипции.

мРНК — матричная РНК

ОРВИ — острая респираторная вирусная инфекция

ПГ — простагландин

ПЦР — полимеразная цепная реакция

РНК — рибонуклеиновая кислота

УГИ — урогенитальные инфекции

УЗИ — ультразвуковое исследование

ФНО — фактор некроза опухоли

ЦМВ — цитомегаловирус

HBD (human beta defensine) — β-дефензин человека

TLR (Toll like receptor) — Toll подобный рецептор

1. 
   Макаров О.В., Бахарева И.В., Кузнецов П.А., Романовская В.В. Современные подходы к прогнозированию преждевременных родов. // Российский вестник акушера-гинеколога, 2007, том 7, №6, с.10-15.
   
2. 
   Gankovskaya O.A., Romanovskaya V.V., Kuznecov P.A., Fenzeleva V.A., Kartashov D.D. TLR and antimicrobial peptide genes expression during prenatal infection // Abstract from Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov, Kyiv, Ukraine, 20-22 september, 2007, p.165
   
3. 
   Макаров О.В., Ганковская Л.В., Козлов П.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Кузнецов П.А. Профилактика и ведение невынашивания беременности и преждевременных родов // Акушерство и гинекология, №5, 2008, с. 19-24
   
4. 
   Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Ганковская О.А., Макаров О.В., Лавров В.Ф., Карташов Д.Д., Кузнецов П.А. Экспрессия противомикробных пептидов клетками слизистой оболочки цервикального канала и нейтрофилами периферической крови у беременных с урогенитальной инфекцией // Вестник РГМУ, №5, 2008, с. 26-29
   
5. 
   Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Кузнецов П.А., Ганковская О.А., Карташов Д.Д. Показатели врожденного иммунитета слизистой цервикального канала при беременности // Проблемы репродукции, 2009, специальный выпуск «Материалы III международного конгресса по репродуктивной медицине», с. 97
   
6. 
   Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Кузнецов П.А., Карташов Д.Д. Современные методы лечения при преждевременных родах // Российский вестник акушера-гинеколога №2, 2009, с. 29-34
   
7. 
   Ганковская Л.В., Макаров О.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Кузнецов П.А., Идрисова Л.С. Прогностическое значение компонентов врожденного иммунитета у беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции // Сборник материалов XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 6-10 апреля 2009г, с. 380.
   
8. 
   Макаров О.В., Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Кузнецов П.А., Романовская В.В., Щукина А.В., Ганковская О.А., Карташов Д.Д. Изменение показателей врожденного иммунитета слизистой цервикального канала при беременности и воспалительных заболеваниях органов малого таза // Сборник материалов XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 6-10 апреля 2009г, с. 395.
   
9. 
   Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Кузнецов П.А., Ганковская О.А., Романовская В.В., Карташов Д.Д., Макаров О.В., Экспрессия генов Toll-подобных рецепторов слизистой цервикального канала при нормальной и патологически протекающей беременности // Вестник РГМУ, № 4 ,2009, с. 34-37.