Общая характеристика
Скачать 121 Kb.
|
Р.В. СиницынаФЕРМЕНТЫ Для студентов физического факультета ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
Ферменты – это особые глобулярные белки (правда, в настоящее время известна одна ферментативная реакция небелковой природы: молекула РНК катализирует свое собственное разрезание на части).Полимерная цепочка белков, состоящая из нескольких сотен звеньев остатков различных типов почти исключительно -аминокислот, имеет компактную форму. Карбоксильная группа одной молекулы аминокислоты, взаимодействуя с аминогруппой соседней молекулы аминокислоты, образует амид. Отдельные пептидные звенья –СО–NH– отличаются друг от друга только боковыми группами R. Эти группы могут содержать свободные амино- или карбоксильные группы, так как некоторые белковые аминокислоты содержат две амино- (лизин) или две карбоксильных (аспарагиновая кислота) группы. Они могут содержать также и амидные группы. Последовательность аминокислот определяет первичную структуру белков. Кроме пептидных связей в белках имеются водородные связи между Ферменты имеют ряд свойств, общих с искусственными химическими катализаторами небелковой природы. Это, например, способность катализировать только энергетически возможные реакции путем снижения энергии активации Еа, направляя реакцию обходным путем через промежуточные реакции, не расходоваться в процессе реакции, ускорять как прямую, так и обратную реакции [3]. В то же время белковая природа ферментов обуславливает ряд особенностей, которые коренным образом отличают их от искусственных катализаторов [4, 5]. Во-первых, это необыкновенно высокая эффективность действия. Например, относительная скорость для реакции разложения перекиси водорода 2H2O22H2O + O2 при температуре 300 К, идущей с гетерогенным платиновым катализатором, который снижает энергию активации Еа с 70 кДж/моль до 45 кДж/моль, равна 2,2104. Если в качестве катализатора этой реакции использовать фермент катализу, то энергию активации можно снизить до Еа=7 кДж/моль. При этом относительная скорость равна 9,31010! Таким образом, ферментативные реакции протекают очень быстро. Обычно их скорость составляет несколько тысяч актов в секунду, а иногда доходит до миллиона. Известны, однако, и медленно работающие ферменты, например, пепсин. Под действием этого катализатора расщепление белков в желудке идет со скоростью всего лишь 10 актов в секунду. Второй отличительной особенностью ферментов является чрезвычайно высокая специфичность по типу реакции. Определенный фермент катализирует строго определенную реакцию. Например, фермент трансаминаза отщепляет от аминокислоты только аминогруппу, а декарбоксилаза – только карбоксильную. Третьей особенностью ферментов является их высокая субстратная специфичность. Даже если какая-то реакция может идти с разными соединениями, данный фермент будет работать только с одним (или немногими). Если фермент действует только на один субстрат, то говорят об абсолютной специфичности. Например, фермент аспартаза катализирует реакцию: фумаровая кислота + аммиак Этот фермент не действует ни на какие другие соединения. Некоторые ферменты катализируют превращение веществ, имеющих общие структурные особенности. Такие ферменты имеют относительную (групповую) специфичность. Например, химотрипсин гидролизует те пептидные связи, которые образованы карбонильной группой ароматических аминокислот. Если фермент катализирует превращение одного из стереоизомеров субстрата, то говорят о стереохимической специфичности. Например, упомянутая выше аспартаза не действует на малеиновую кислоту или на D-аспарагиновую кислоту. Стереохимическая специфичность ферментов теснейшим образом связана с одной из основных особенностей живых организмов – их способностью к синтезу оптически активных органических соединений. Существуют также ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию, но представленные различными молекулярными формулами. Если это обусловлено генетическими причинами, то говорят об изоферментах.. Изоферменты различаются по физико-химическим свойствам и могут быть отделены друг от друга путем электрофореза, хроматографически или другими методами. Для каждого органа характерен определенный набор изоферментов. Поэтому при некоторых заболеваниях, сопровождающихся разрушением клеток или повышением проницаемости мембран, в крови повышается активность тех изоферментов, которые преимущественно содержатся в пораженном органе. Так, например, фермент креатинфосфокиназа существует в виде трех изоферментов, обозначаемых ММ, МВ и ВВ. Креатинфосфокиназа МВ преимущественно содержится в сердечной мышце. Поэтому при инфаркте миокарда его активность в плазме крови повышается, что может быть использовано в диагностике этого заболевания. (С проблемами современной энзимодиагностики можно ознакомиться в работе [6]). До середины 60-х годов количество обнаруживаемых в природе ферментов исчислялось сотнями, в настоящее время их несколько тысяч. Можно надеяться, что сейчас нам известны все ферменты, участвующие в основных метаболических процессах. Однако возможны и неожиданности. Так совсем недавно был открыт новый фермент, синтезирующий в человеческом организме оксид азота NO, из давно известной аминокислоты аргинина. Все ферменты разделяются на две большие группы: однокомпонентные, состоящие только из белка, и двухкомпонентные, состоящие из белка, называемого апоферментом, и небелковой частью, называемой простетической группой. Апофермент называют также белковым носителем, а простетические группы – активными группами, которые для многих ферментов представляют собой производные витаминов или нуклеотидов. Например, двухкомпонентным ферментом является пируватдекарбоксилаза, катализирующая расщепление пировиноградной кислоты на двуокись углерода и уксусный альдегид: CH3COCOOH В данном случае простетическая группа фермента, тиаминпирофосфат, образована молекулой тиамина (витамина В1) и двумя остатками фосфорной кислоты. Простетические группы, легко отделяющиеся от белковой части фермента, называются коферментами. Активностью обладает только комплекс апофермент + кофермент, называемый холоферментом. Исключительно высокая специфичность действия ферментов объясняется их белковой природой. Так пиридоксалевые ферменты, содержащие один и тот же кофермент (пиридоксальфосфат), могут принадлежать к различным классам и катализировать самые разнообразные реакции. Специфичность их действия зависит от природы апофермента. Многие ферменты содержат металлы, без которых фермент не обладает активностью. Эти металлы называют кофакторами. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ УЧЕНИЯ О ФЕРМЕНТАХ Термин «фермент» был предложен в начале 17 в. голландским естествоиспытателем Я.Б. Ван-Гельмонтом (1579 - 1644). Однако он был виталистом и считал, что жизненные процессы реализуются особыми «духами жизни» («археями»). «Ферментом» он называл неизвестный агент, активно участвующий в процессе спиртового брожения. Первое научное представление о ферментах было высказано русским химиком К.Г.С. Кирхгофом (1764 – 1833). В 1811 г. Он сообщил о превращении крахмала в сахар, а в 1814 г. открыл ферментативное действие водных вытяжек из проросшего ячменя, расщепляющих крахмал [7]. Можно считать, что эти работы положили начало науки о ферментах как самостоятельному разделу органической химии. Спустя 19 лет, в 1833 г. французскими химиками А. Пайеном и Ж. Персо впервые был выделен из солода препарат фермента амилазы. Их работы послужили толчком для выделения и получения ферментов и способствовали развитию препаративной химии. В середине 19 в. разгорелась дискуссия о природе брожения между французским микробиологом и химиком Л. Пастером (1822 – 1895) с одной стороны, и немецким химиком Ю. Либихом (1803 – 1873), французским химиком П.Э.М. Бертло (1827 – 1907) и французским физиологом К. Бернаром (1813 – 1878), с другой. Опираясь на свои экспериментальные исследования, Л. Пастер развивал представление о том, что брожение вызывается лишь живыми микроорганизмами и что этот процесс неразрывно связан с их жизнедеятельностью. Сторонники Ю. Либиха развивали представление о химической природе брожения, считая, что оно является следствием образования в клетках микроорганизмов, подобных выделяемой из солода амилазе. Здесь уместно напомнить, что в то время собственно ферментами называли «организованные ферменты», то есть сами живые организмы. Термин же энзим (от греческого en – в, внутри и Спор длился несколько десятилетий. Открытие аналогии между каталитическими химическими и ферментативными реакциями получило подтверждение в работах П.Э.М. Бертло, Х.Ф. Шенбайна и др. Были также попытки теоретически обосновать каталитический механизм ферментативных реакций [8]. Однако выделить из разрушенных дрожжевых клеток растворимый катализатор, способный вызвать брожение, долго не удавалось. И только через два года после смерти Л. Пастера (в 1897 г.) Э. Бюхнер опубликовал работу «Спиртовое брожение без дрожжевых клеток», в которой экспериментально показал, что бесклеточный дрожжевой сок осуществляет спиртовое брожение так же, как и неразрушенные дрожжевые клетки. Растирая дрожжи с инфузорной землей, Э. Бюхнер выделил из них бесклеточный растворимый ферментативный препарат и назвал его зимазой. Открытие Э. Бюхнера поставило точку в долгом споре и имело большое значение для дальнейшего развития энзимологии. Н.Н. Чернов напоминает нам [9] имя первой женщины биохимика Марии Михайловны Манассеиной (урожденной Корнаковой, 1843 – 1911). За 25 лет до Э. Бюхнера она на немецком и русском языках опубликовала результаты своих экспериментальных исследований, доказывающих образование спирта в суспензии убитых клеток. Британский исследователь Джон Лагнадо в работе [10] сообщает, что отыскал в Британском музее статью М.М. Манасеиной от 1872 г., которая содержит детальный анализ экспериментов, проведенных ею во время стажировки в Политехническом институте г. Вены у профессора Ю. Вайснера. Эта статья завершается выводом о том, что живые клетки совсем не обязательны для алкогольного брожения. Сама Манассеина полностью осознавала фундаментальность своей работы. Эту статью заметил Ю. Либих и пригласил автора продолжить исследования в его лаборатории в Гессене. К сожалению, М.М. Манассеина по семейным обстоятельствам должна была вернуться в С.-Петербург, где в последствии прославилась своими работами по высшей нервной деятельности. Э. Бюхнер прекрасно знал о работах М.М. Манассеиной, но никогда на них не ссылался. В 1907 г. он был удостоен Нобелевской премии, а имя М.М. Манассеиной на ее родине не упоминается ни в энциклопедиях, ни в справочниках. Начиная с 1897 г. ведется постоянная работа по выделению и очистке ферментов. Это касается, в первую очередь, ферментов, действующих вне вырабатывающих их клеток, например, пищеварительных ферментов. Надо заметить, что такая работа велась и раньше. Так русский биохимик А.Я. Данилевский (1838 – 1923) впервые предложил и разработал адсорбционный метод разделения ферментов поджелудочной железы и разделил трипсин и амилазу еще в 1862 г. (Кстати позднее он же предложил теорию строения белковой молекулы). Однако, широко адсорбционный метод начал применяться только в 20 в. И, в первую очередь, здесь следует отметить работы Р. Вильштеттера (1872 – 1942) и сотрудников. Этот известный немецкий химик и биохимик (Нобелевская премия 1915 г. за работу, посвященную химическому строению алкалоидов, кровяных пигментов и хлорофилла), применяя в своих исследованиях адсорбционный метод, внес существенный вклад в энзимологию. Но его работы имели и отрицательное значение. Дело в том, что, изучая свойства отдельных ферментов, он сделал принципиально неправильный вывод о том, что ферменты не принадлежат ни к одному из известных классов органических соединений. Безусловно, выдающимся успехом в выяснении химической природы ферментов следует считать работы американских биохимиков Дж.Б. Самнера и Дж.Х. Нортропа. Впервые в 1926 г. Дж.Б. Самнер выделил в кристаллическом виде из семян канавалии фермент уреазу. А вслед за ним Дж.Х. Нортроп (с сотрудниками) впервые выделил в кристаллическом виде протеолитические ферменты: пепсин (1830 г.), трипсин (1932 г.) и другие. Работы этих выдающихся ученых указали путь получения высокоочищенных кристаллических препаратов ферментов и вместе с тем неопровержимо доказали белковую природу ферментов. В 1946 г. Дж.Б. Самнер, Дж.Х. Нортроп и У.М. Стэнли (вирусолог) за работы в области энзимологии и вирусологии удостоены Нобелевской премии по химии. Другим важным условием прогресса в изучении ферментов было дальнейшее углубление знаний о кофакторах ферментов. В начале 30-х годов были получены в чистом виде органические коферменты ферментативных процессов биологического окисления (коферменты гидрогеназ и желтых окислительных ферментов). Здесь, прежде всего, следует отметить работы немецкого биохимика и физиолога О.Г. Варбурга, который за открытие природы и функций двухатомных ферментов в 1931 г. был удостоен Нобелевской премии в области физиологии и медицины. Работы О.Г. Варбурга расширили представление о механизме окислительно-восстановительных процессов в живой клетке. В 1937 г. были удостоены Нобелевской премии швейцарский химик-органик и биохимик П. Каррер и английский химик-органик У.Н. Хоуорс. П. Каррер установил строение и синтезировал ряд биологическии активных природных соединений, в том числе витаминов А, В1, Е, К и их коферментные формы. А в 1938 г. за работы по каротиноидам и витаминам получил Нобелевскую премию немецкий биохимик Р. Кун. В середине 20 в. благодаря развитию методов физико-химического анализа и методов белковой химии расшифрована структура многих ферментов. Так американские биохимики С. Мур, У. Стайн и К. Анфинсен, применяя хроматографические методы химического анализа (автоматическую аппаратуру для хроматографического разделения и количественного определения аминокислот), в 1956 г. показали, что фермент рибонуклеаза из поджелудочной железы быка представляет собой полипептидную цепочку, состоящую из 124 аминокислотных остатков, соединенных в 4-х местах дисульфидными связями. Таким образом, впервые появилась возможность создания полной модели фермента. За основополагающий вклад в химию ферментов эти ученые в 1972 году были удостоены Нобелевской премии. С помощью рентгеноструктурного анализа расшифрована вторичная и третичная структура ряда ферментов. Так в 1965 г. английский ученый Д. Филлипс методом рентгеноструктурного анализа установил трехмерную структуру лизоцима. Было показано, что многие ферменты обладают также и четвертичной структурой, то есть их молекула состоит из нескольких идентичных или различных по свойству и структуре белковых субъединиц. Работы по изучению строения ферментов развиваются по трем направлениям: изучение строения белковой части, исследования простетических групп, способа присоединения коферментов к белку и принципа их функционирования [11]. Бурные темпы развития энзимологии повлекли за собой возникновение определенных затруднений в систематизации информации, что затрудняло обмен опытом в этой области. Поэтому Международным биохимическим союзом была создана Комиссия по ферментам, которая в период с 1957 по 1961 г. разработала рациональные предложения по упорядочению состояния систематики и номенклатуры ферментов, энзимологической терминологии и символики. Предложенная классификация и номенклатура были утверждены на заседании Генеральной ассамблеи Международного биохимического союза, которое состоялось в 1961 г. в Москве. Согласно принятой классификации, ферменты разделили на 6 классов: 1) оксиредуктазы, 2) трансферазы, 3) гидролазы, 4) лиазы, 5) изомеразы, 6) лигазы. Шифр каждого фермента содержит четыре числа, разделенных точками. Первая цифра указывает класс, вторая – подкласс, третья подподкласс, четвертая – порядковый номер в данном подподклассе. Например, фермент аргиназа, расщепляющий аргинин на орнитин и мочевину, имеет шифр 3.5.3.1, то есть относится к классу гидролаз, подклассу ферментов, действующих на непептидные С – N – связи, и подподклассу ферментов, расщепляющих эти связи в линейных (не циклических соединениях). Кроме шифра, классификация и номенклатура ферментов включает также систематические и тривиальные (рабочие) названия. Систематическое название состоит из двух частей. Первая часть представляет собой название субстрата, вторая часть с окончанием «аза» указывает на катализируемую ферментом реакцию. В качестве тривиальных названий ферментов в большинстве случаев сохранены общепринятые традиционные названия. Например, фермент расщепляющий гидролитическим путем мочевину на аммиак и гидроксид углерода (относится к классу гидролаз, шифр 3.5.1.5) имеет систематическое название: «мочевина-амидогидролаза», а тривиальное – «уреаза». Систематическому названию L-аргинин-амидиногидролаза соответствует рабочее – аргиналаза [12 – 13]. Так как ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых количествах, то непосредственно определяют не концентрацию фермента, а его активность, о которой судят по скорости ферментативной реакции. Рекомендована международная единица активности фермента (М.Е.). Одна международная единица соответствует тому количеству фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата за
Остановимся кратко на представлениях о механизме действия ферментов. Для объяснения механизма действия было предложено много теорий. Все они исходят из экспериментально установленного факта, что биокатализаторы не могут сделать возможным протекание процессов, запрещенных с точки зрения термодинамики, они увеличивают скорость разрешенных процессов, снижая энергию активации. Таким образом, ферменты сокращают время достижения состояния подвижного равновесия, при этом в равной мере возрастает скорость как прямой, так и обратной реакции. К фундаментальным представлениям о ферментативном катализе относится положение о многоступенчатом характере превращения веществ под действием белкового катализатора. Впервые гипотезу о том, что в основе ферментативных реакций лежит обратимое взаимодействие субстрата с ферментом (с образованием комплекса) высказали в начале 20 в. А. Браун и затем В. Анри. Доказали это Л. Михаэлис и М. Ментен, а позже Г.Э. Бриггс и Дж.Б.С. Холдейн. Начало современным представлениям о механизме действия ферментов было положено работой немецких ученых Л. Михаэлиса и М. Ментен, опубликованной в 1913 г. Согласно теории Михаэлиса-Ментен, первым этапом любого ферментативного процесса является реакция между ферментом Е и субстратом S, приводящая к образованию (с константой скорости k1) промежуточного фермент-субстратного комплекса ЕS, который может диссоциировать на фермент и субстрат с константой скорости k–1 и подвергаться практически необратимому расщеплению и исходный фермент и продукт Р – с константой скорости k2. Если [S]o[Е]o то концентрация комплекса [ES]=const и начальная скорость двухстадийной ферментативной реакции v 0 описывается уравнением: v 0 где V – максимальная скорость реакции, достигаемая при полном насыщении фермента субстратом, а соотношение констант В том случае, когда определяемые из опыта константы k2 и KS или KM являются эффективными величинами (зависящими от pH среды, присутствия в системе ингибиторов или активаторов, наличия дополнительных стадий и т.д.)? их называют соответственно «каталитической константой» (Ккат) и «кажущейся константой» Михаэлиса (КМ(каж)). Уравнение v Кинетические параметры (kкат и КМ(каж)) обычно определяют, проводя линеаризацию экспериментальных данных, чаще в координатах Лайнуивера-Берка (1/v 0 , 1/[S]o). В 50-х годах проблема механизма действия ферментов атаковалась по двум направлениям: создание общих теорий ферментативного действия и изучение деталей строения отдельных активных центров. Интересна судьба теорий ценных реакций, которые были применены для объяснения ферментативных, а именно окислительных процессов. Разработанные механизмы можно подразделить на две группы. Первая группа гипотез стремилась объяснить цепные механизмы реакций для оксидаз и дегидрогеназ. Вторая группа гипотез допускала осуществление всего процесса в пределах ферментативного комплекса и поэтому не связывала процесс с передачей цепи лишь посредством свободных радикалов. В результате было выяснено, что использование цепных механизмов не применимо для объяснения ферментативных процессов, так как не объясняет специфичность действия ферментов и его обратимость. В 60-х годах были опубликованы ряд монографий по кинетике ферментативных процессов. Первая монография вышла в 1958 г. на английском языке, ее авторами были М. Диксон и Э. Уэбб. В русском переводе он появилась в 1961 году. Книга М. Диксона и Э. Уэбба [14] – это курс общей энзимологии, ибо в ней описываются общие для всех ферментов свойства, закономерности каталитического действия и т. д. Также большой интерес представляет монография П. Ашмора [15], в которой охватываются механизм действия катализаторов и кинетика каталитических реакций. Большой вклад в развитие отечественной энзимологии внес И.В. Березин. Им созданы и развиты методы анализа ингибирования ферментативных реакций, развиты кинетические модели полиферментных реакций, процессы электронного транспорта, методы иммобилизации ферментов. Заложены основные методы иммуноферментного анализа, биолюминесцентного анализа, а также создания светорегулируемых ферментов (бессеребряной ферментной фотографии) [16]. Большой вклад в исследование механизма действия ферментов и его структуры внесли А.А. Клесов [17 – 19], К. Мартинек [20], М.В. Волькенштейн [21], Ч. Уолтер [22] и другие. Подробно история развития отечественной энзимологии изложена в обзоре [23]. В свое время было предложено несколько вариантов "узнавания" фермента субстратом. Первоначально была принята идея Э. Фишера о том, что субстрат и фермент подходят друг к другу, как ключ к замку [24]. Д. Кошланд [25] выдвинул идею индуцированного соответствия фермента и субстрата, согласно которой субстрат вызывает изменение конформации активного центра фермента [11, 21, 25 – 27]. Высказывалась также идея о том, что при связывании фермента и субстрата возникает принудительная деформация субстрата, что приводит к изменению положения электронной плотности [28, 29]. М.В. Волькенштейн предложил "капельную" модель фермента [30]. Были выдвинуты концепции, предполагающие, что белок в растворе имеет несколько конформаций и субстрат выбирает одну активную конформацию. Описанный механизм был назван конформационной адаптацией [31] и флуктуационным соответствием [32]. Рассмотрение всех концепций ферментативного катализа подробно дано в обзорной статье Е. М. Попова [33]. Исследование зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата является обязательным элементом изучения любого фермента, так как оно позволяет оценить основные черты механизма катализируемой им реакции и получить количественную кинетическую характеристику процесса. Исследование кинетики ферментативных реакций в стационарном режиме – один из наиболее распространенных способов изучения механизма действия фермента [14, 22, 34, 35]. При исследовании реальных ферментативных систем условие стационарности выполняется приблизительно. Для того чтобы можно было применить принцип стационарности, достаточно, чтобы скорость изменения концентрации промежуточного соединения была много меньше скорости изменения в растворе концентрации субстрата и продукта. Для реакций, протекающих более сложными путями, чем механизм Михаэлиса-Ментен [36], для выполнения стационарности необходимы дополнительные условия, определяемые соотношением констант скоростей индивидуальных стадий. Полную информацию о детальном механизме ферментативных реакций с участием ряда промежуточных соединений дает изучение процесса в нестационарном режиме. Необходимо отметить, что формально-кинетическому анализу стационарной кинетики ферментативных реакций посвящено достаточно много обзоров и монографий [14, 22, 34 – 36] в то время как отсутствует полное и последовательное изложение данных нестационарной ферментативной кинетики. Предстационарный и релаксационный режимы исследования ферментативных реакций [17, 22, 36 – 38] представляют собой наиболее часто используемые и хорошо разработанные способы исследования механизмов реакций в нестационарном режиме. Исследование нестационарной кинетики ферментативных реакций связано с использованием экспериментальных методов исследования кинетики "быстрых" реакций в растворе, так как период протекания нестационарной ферментативной реакции достаточно мал. Использование совокупности разных физико-химических методов для обоснования кинетической модели приводит одновременно к результатам, дающим вместе с тем и важнейшую информацию о механизме процесса. Эти же данные способствуют одновременно уточнению самой модели. Возникает вопрос: чем отличается кинетическая модель от механизма реакций? Согласно [39] кинетическая модель – количественная характеристика скорости каталитического процесса в виде ее математического описания по разным реализуемым в данных условиях направлениям, обоснованная определенными стационарными схемами, учитывающая существенные сопутствующие эффекты, в том числе влияние реакционной системы на катализатор. Механизм реакции – всесторонняя качественная характеристика ее внутренних закономерностей, отражающая последовательность элементарных стадий, их сопряжение, природу промежуточных соединений с учетом побочных взаимодействий в данных условиях. Итак, в кинетической модели главное - количественное описание скорости процесса, а в механизме реакции - качественное описание природы промежуточных соединений и их взаимосвязи. Известно, что активность фермента может быть уменьшена с помощью разнообразных воздействий. Такое снижение скорости ферментативных реакций принято называть торможением, или ингибированием. Большое значение для регуляции действия ферментов in vivo имеют изменения их активности при связывании специфических реагентов функциональными группами, находящимися вне активного центра белковой молекулы. Такое взаимодействие приводит к изменению конформации ферментов и его активности. Оно может быть конкурентным и неконкурентным [11, 14, 15, 34, 40 – 42]. Ингибиторный анализ не может ограничиваться качественной оценкой действия или не действия вещества на активность фермента. Обязательный элемент анализа - количественная оценка реакционной способности ингибитора, которая может быть дана с помощью кинетических параметров. По механизму взаимодействия с ферментами ингибиторы делятся на две большие группы. Ингибиторы, снижающие активность фермента в результате взаимодействия с теми же самыми центрами фермента, что и субстраты, называются конкурентными. Ингибиторы, которые снижают активность фермента вследствие реакции с другими функциональными группами, носят название неконкурентные. В первом случае ингибитор образует неактивное соединение только со свободным ферментом. Во втором случае (неконкурентное ингибирование) ингибитор взаимодействует со всеми формами ферментов. На практике нередко встречаются случаи смешанного торможения, когда один и тот же ингибитор может реагировать со свободным ферментом в разных точках, а также с фермент-субстратным комплексом на разных стадиях его превращения [14, 17, 34, 40, 42]. Существуют и такие виды ингибирования как бесконкурентное и псевдоингибирование [34, 40, 42]. Псевдоингибирование ферментов не нашло широкого признания в энзимологии [14, 18, 34, 43, 44], хотя в практике накопилось достаточно экспериментальных данных, подтверждающих его существование. Псевдоингибирование интересно тем, что, несмотря на соотношение начальных скоростей реакций vi < v 0 , типичное для ингибирования и выполнимое на всем интервале обратных концентраций расщепляемого субстрата, прямая ингибируемой реакции пересекает прямую исходной реакции в первом квадранте координат Лайнуивера-Берка. Отнесение данного типа ингибирования к псевдоингибированию обусловлено тем, что присутствие таких ингибиторов приводит не к уменьшению, а к увеличению максимальных скоростей реакций, что более типично для активации. Однако к активируемым реакциям этот тип не подходит, поскольку первичный эффект, проявляющийся в уменьшении начальной скорости (vi < v 0 ) – признак ингибирования, а не активации. Исследованию активации ферментов, разработке практических и теоретических аспектов этого эффекта в литературе уделялось значительно меньше внимания, чем ингибированию. В книгах [34, 40, 45, 46] рассмотрена активация ферментов другими соединениями. На активность фермента также влияет рН среды и температура [11, 14, 15, 18, 34]. Причины влияния рН на скорость ферментативной реакции состоят в том, что белковая молекула фермента является амфотерным полиэлектролитом, каталитический эффект которого зависит от степени ионизации функциональных групп, определяющих структуру и реакционноспособность активного центра фермента. В связи с этим исследования рН-зависимости скорости ферментативных реакций играют важную роль в идентификации ионогенных групп ферментов, участвующих в каталитическом процессе. Исследование температурной зависимости позволяет определить термодинамические характеристики реакций ферментативного катализа (вычисление энергии активации, энтальпии, свободной энергии) [34]. Практическому использованию ферментов до 70-х годов мешала их низкая устойчивость и дороговизна. Усовершенствование методов очистки ферментов значительно снизило их стоимость и повысило доступность. Однако основные успехи, позволившие широко использовать ферменты, связано с получением иммобилизированных ферментов [47, 48]. Идея «пришить» фермент к матрице появилась еще в конце 40-х годов, а была реализована только в начале семидесятых. Основная технологическая проблема заключалась в поиске подходящих матриц (как правило, это полимерные молекулы). Фермент присоединяется к ним химическим путем (ковалентными связями), однако в ряде случаев соединение происходит за счет электрических или гидрофобных связей. Иногда можно просто инкапсулировать фермент внутрь полимерного микроконтейнера, липидного бислойного пузырька (липосомы) или обволакивающего гелеобразного соединения [49, 50]. Матрица может быть как растворимой в воде, так и нерастворимой. Нерастворимые носители позволили использовать ферменты в технологических процессах. Можно иммобилизировать целые клетки [51, 52]. Например, в производстве этилового спирта в настоящее время широко используются иммобилизированные клетки дрожжей. В настоящее время энзимология – это обширная область знания с многочисленными ответвлениями в другие науки. Она тесно связана с биохимией, бактериологией и микробиологией, генетикой, ботаникой, а также фармакологией, физиологией и медициной. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Ферменты играют исключительно важную роль во всех процессах жизнедеятельности, направляя и регулируя обмен веществ. Поэтому любое нарушение действия ферментов может повлечь за собой серьезные последствия для живого организма. В связи с этим особое значение приобретает знание факторов, провоцирующих не только изменение каталитической активности ферментов, «отравляющих» их, но и нарушающих их способность к взаимодействию с другими внутриклеточными партнерами реакции, нарушающих способность к регуляции. При изучении активности фермента в пробирке (in vitro) не всегда удается выявить такие отклонения, так как они могут проявляться только внутри клетки в организме (in vivo). Поэтому можно сказать, что перспектива дальнейшего развития энзимологии связана с поиском путей исследования поведения ферментов в целой клетке. В настоящее время задача определения активности ферментов непосредственно в клетках организма является исключительно сложной. В очень редких случаях можно приблизительно судить об уровне внутриклеточной активности ферментов, определяя, например, в сыворотке крови, продукты их деятельности. Иногда для этой цели используется изотопный метод. Хорошо разработана техника выявления какого-либо фермента в клетке иммунными методами. Для этого предварительно получают высокоспецифичные антитела (принцип образования комплекса антиген – антитело). Судить о наличии в клетке определенного фермента можно также по нуклеотидной последовательности молекул нуклеиновых кислот, характерной для данного фермента. Были попытки проследить функции отдельных ферментов, получая линии мышей, у которых отсутствует какой-либо фермент. И очень часто никаких изменений у организмов выявить не удавалось. Может быть клетки могут включать дублирующие механизмы, позволяющие компенсировать отсутствие данного фермента? А может быть неизвестно, где эти отклонения искать и какова форма их проявлений и время? Исследования, проведенные в последнее десятилетие свидетельствуют о том, что ферменты in vivo образуют структурные комплексы и ансамбли как друг с другом, так и с участниками клеточных и внутриклеточных мембран. Их функциональное значение пока не ясно. Однако, существует предположение, что образование таких комплексов регулирует активность ферментов. К настоящему времени полностью определена трехмерная пространственная структура сотен ферментов, изучены кинетические характеристики и механизмы их действия. Но до полного понимания внутриклеточных механизмов регуляции действия ферментов еще далеко. Нет ясного и четкого ответа даже на вопрос о субстратной специфичности фермента в клетке и пробирке, совпадают они или нет? Ведь выделенные из клетки индивидуальные белки или их комплексы могут оказаться либо результатом распада естественного комплекса, либо – нехарактерного объединения изначально изолированных ферментов. Применение метода сайт-специфического мутагенеза (строго заданных единичных замен в нуклеотидных последовательностях белков) показало, что многие мутации для функционирования белков несущественны. В то же время иногда замена всего лишь одной аминокислоты меняет функцию белка коренным образом. Путем сайт-специфического мутагенеза иногда удается повысить устойчивость некоторых ферментов к воздействию различных денатурирующих агентов. Стабильность ферментов можно повысить в сотни и тысячи раз в результате иммобилизации ферментов (присоединении их к матрице носителя). Способы иммобилизации подбираются так, чтобы сохранить активность фермента или изменить в нужном направлении. Путем иммобилизации можно менять не только стабильность и активность ферментов, но и субстратную специфичность, сродство к субстрату, повысить устойчивость ферментов к действию высокой температурыи изменениям рН (менять оптимальные значения температуры и рН), получать чистые продукты, а ферменты использовать вторично. Изучение иммобилизированных ферментов прояснило многие детали ферментативного катализа и открыло дорогу принципиально новым подходам в исследовании ферментов. В таких системах фермент работает на границе раздела фаз, внутри так называемых «обращенных» мицелл [53, 54]. Однако пока нет полной уверенности в том, что предлагаемые модельные системы адекватны живой клетке. По крайней мере некоторый пессимизм по поводу того, что в энзимологии скоро будет нечего делать абсолютно не оправдан. Думается самое интересное еще впереди. ЛИТЕРАТУРА
Каталог: archive -> old.sgu.ru -> files -> nodes nodes -> Темы контрольных работ. Специалитет Психология социального поведения nodes -> Исследование в психологии. Специфика психологического исследования на разных уровнях методологии nodes -> Темы рефератов и вопросов для самостоятельной подготовки nodes -> О. Ю. Абакумов «Око земного бога» nodes -> Вопросы для вступительных испытаний поступающих в магистратуру юридического факультета для лиц не имеющих высшего юридического образования по теории государства и права, конституционному праву России, уголовному праву России nodes -> История и теория русского авангарда 10-х годов (спецкурс) nodes -> Методические рекомендации по написанию контрольной работы Выполнение контрольной работы заключается в усвоении теоретической базы по судебной медицине и психиатрии nodes -> Темы рефератов. Сравнительный анализ психоаналитических подходов к здоровью личности З. Фрейда, К. Г. Юнга, А. Адлера Скачать 121 Kb. Поделитесь с Вашими друзьями:
|
и 
, определяющие вторичную структуру (спираль). В белках имеет место также взаимодействие NH2, OH, COOH-групп, не принимающих участия в образовании пептидной связи (третичная структура). Подробнее о третичной и четвертичной структуре белков можно прочесть в работах [1, 2].
L-аспарагиновая кислота.
– закваска) был введен В. Кюне в 1876 г. для «неорганизованных ферментов», которые секретируются клетками в желудок или кишечник. Теперь эти термины используются как синонимы.
,
получило название константы Михаэлиса. Из этого уравнения видно, что константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимально возможной. Если k2 мала пренебрежимо, то 
, где KS – константа субстрата, которая служит мерой сродства субстрата к ферменту.
называют уравнением Михаэлиса-Ментен. Оно иллюстрирует гиперболическую зависимость скорости ферментативной реакции от начальной концентрации субстрата и линейную зависимость – от концентрации фермента.